L’optogenetica è una tecnica molto raffinata che combina ottica, genetica e biologia cellulare per controllare le attività cellulari, in particolare quelle neuronali. Nella maggior parte dei casi, l’optogenetica consiste nell’introdurre canali ionici ricombinanti attivati dalla luce, come channelrhodopsin (ChR2) o halorhodopsin (NpHR), all’interno di cellule eccitabili (come i neuroni). L’attivazione mirata di questi canali attraverso un impulso luminoso provoca un flusso di ioni che induce l’accensione o lo spegnimento selettivo dei neuroni. Di conseguenza, l’optogenetica rappresenta un potente strumento per i neuroscienziati, consentendo loro di silenziare, sincronizzare e attivare neuroni o interi circuiti.
Dal punto di vista tecnologico, l’optogenetica può essere effettuata con vari set up. Comunemente, la fotostimolazione può essere indotta utilizzando luce visibile (i.e. LED) oppure infrarossa (Laser dei microscopi 2 fotoni), mentre l’imaging dipende dallo strumento utilizzato. Nel caso della microscopia a 2 fotoni, l’imaging viene effettuato con laser infrarossi (IR), i quali comportano due principali vantaggi. L’impiego di laser a lunga lunghezza d’onda come gli IR, aumenta notevolmente il potere penetrante e riduce i danni indotti dalla fototossicità; ciò rende la microscopia a 2 fotoni perfetta per esperimenti in vivo, dove penetrare il campione senza danneggiarlo è chiaramente essenziale.
La microscopia a 2 fotoni è infatti l’approccio più utilizzato nel campo delle neuroscienze, dove la visualizzazione e l’analisi delle attività neuronali in vivo è importantissima. La combinazione della microscopia a 2 fotoni con l’optogenetica, diventa dunque una strategia molto raffinata e efficace per studiare e controllare circuiti neuronali in vivo.
Un esempio molto elegante di optogenetica con 2 fotoni è mostrato in questo esperimento effettuato con FEMTO 3D ATLAS. Questo microscopio multifotone di Femtonics consente l’imaging ad altissima frequenza in regioni tridimensionali e, quando configurato con 2 laser (o 1 laser e 1 LED), può effettuare fotostimolazione e imaging quasi-simultaneamente. FEMTO 3D ATLAS consente la selezione di multiple aree di stimolazione e di scansione: in figura 1 è possibile notare il set-up di un esperimento d’optogenetica in vivo. I quadrati rossi rappresentano le aree selezionate per essere stimolate, mentre i quadrati azzurri le aree selezionate per l’imaging. Quest’ultime sono state selezionate secondo uno schema di scansione con regioni più ampie, ma soprattutto su piani differenti. Infatti, grazie alla capacità di Femtonics di accedere a regioni tridimensionali con grande velocità, è possibile scansionare aree di interesse su piani focali differenti. Una volta selezionate le aree di interesse, imaging e stimolazione si alterneranno secondo precisi schemi temporali (settati dall’user) e le registrazioni delle attività neuronali pre e post stimolazione verranno effettuate in real-time.
Figura 1: Cellule esprimenti ChrimsonR-mRuby2 e GCaMP6f sono state stimolate e visualizzate con la modalità 3D Chessboard (ArticoloChessboard), la quale consente di selezionare più aree a forma di quadrato su piani differenti. I quadrati rossi rappresentano l’area di 10x10um che verrà stimolata, mentre i quadrati azzurri di 25x25um l’area dove avverrà la registrazione.
La stimolazione è stata applicata per 10 impulsi da 1ms (10Hz repetition rate), mentre l’acquisizione a 12Hz. Nella parte destra dell’immagine è possibile visualizzare le registrazioni delle attività neuronali pre e post stimolazione (raffigurata con la linea rossa).
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