Come ampiamente descritto nella nostra application note dedicata ai neuroni (Neurone), la tecnologia principe nelle neuroscienze è la microscopia a 2 fotoni. Grazie al suo potere penetrante e alla ridotta fototossicità, questo sistema di imaging consente ai neuroscienziati di visualizzare in vivo morfologia e fisiologia di tessuti come la corteccia cerebrale. La possibilità di accedere a tessuti profondi e altamente scattering è dovuta all’impiego di laser caratterizzati da lunghezze d’onda ampie (dunque ridotta energia) che colpendo simultaneamente due volte (con 2 fotoni) il fluoroforo, generano un segnale fluorescente.
Tuttavia, non sempre il potere penetrante dei microscopi a 2 fotoni è sufficiente. Fortunatamente è possibile migliorare ulteriormente il potere penetrante di questi strumenti attraverso l’utilizzo di laser con lunghezze d’onda ancora maggiori, al fine di ottenere un’eccitazione a 3 fotoni. La struttura e la composizione dei microscopi a 3 fotoni sono di fatto molto simili a quelle a 2 fotoni, ma utilizzano laser con lunghezze d’onda superiori ai 1300nm. La natura non-lineare della fluorescenza a 3 fotoni circoscrive l’eccitazione del campione ad un volume molto ristretto limitando la generazione di fluorescenza secondaria (fuori piano focale), limitando effetti di photobleaching, generando un minor scattering con conseguente miglioramento della risoluzione e, come anticipato, ottenendo un maggior potere penetrante.
Come nella microscopia a 2 fotoni, anche in quella a 3 fotoni non è necessario l’inserimento di un pinhole nel percorso ottico, avendo appunto un’eccitazione del campione confinata e precisa. Tale sistema permette di effettuare scansioni punto a punto di regioni tridimensionali ad alta risoluzione e le sue applicazioni variano dalle neuroscienze all’oncologia. Un esempio è riportato in figura 1, dove è possibile apprezzare alcuni frames di una Z-Stack di 1mm di corteccia cerebrale murina. In particolare, in viola sono visibili i vasi sanguigni, mentre in verde i periciti associati. Un “tuffo” nel cervello di topo che rende possibile l’osservazione di strutture del sistema circolatorio per un millimetro senza perdere di qualità dall’immagine più in superficie a quella più in profondità.
Figura 1: Sequenza di immagini di una Z-Stack di 1000μm di spessore della corteccia cerebrale di topo. In viola i vasi sanguigni, mentre in verde periciti marcati con GFP. Immagini gentilmente concesse dal Dr. Severin Filser. Consigliamo la visione del video intero a questo link: 3PImaging.
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