Nanolive è virale

In uno dei nostri precedenti articoli abbiamo mostrato come la tecnologia Nanolive sia adatta per monitorare gli effetti di un virus su una popolazione cellulare (NanoliveCOVID).

Grazie all’olotomografia infatti è possibile visualizzare colture cellulari nel tempo senza l’utilizzo di marcatori fluorescenti. Nonostante l’altissima risoluzione label-free però (>200nm in XY), Nanolive non consente la visualizzazione di strutture nanometriche come i virus. Osservare i virus è infatti un processo molto difficoltoso realizzabile solamente attraverso la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Le immagini dettagliate della struttura virale prodotte con i TEM però richiedono campioni fissati, limitando totalmente l’acquisizione di dati nel corso del tempo. Un ottimo compromesso è rappresentato dalla fluorescenza: sebbene i marcatori compatibili con il live-imaging non permettono di visualizzare la struttura virale con lo stesso livello di dettaglio del TEM, questi coloranti consentono l’individuazione dei virus all’interno delle cellule. In molti casi, tale visualizzazione risulta più che sufficiente ai fini della ricerca, in quanto consente di discriminare cellule infettate da quelle sane.  

Per visualizzare strutture nanometriche, Nanolive ha implementato nei suoi strumenti un modulo a fluorescenza LED, il quale permette di combinare ai video in olotomografia anche video in fluorescenza. Questa configurazione consente dunque di identificare e seguire tutte le strutture inferiori ai 200nm, previa opportuna marcatura a fluorescenza. L’utilizzo della fluorescenza reintroduce i problemi relativi alla fototossicità, ma l’implementazione di un sistema LED risulta ottimale per la riduzione dai danni indotti dall’irradiamento del campione. Inoltre, per ridurre ulteriormente fototossicità e photo-bleaching è possibile acquisire immagini a fluorescenza a frequenze inferiori rispetto al video olotomografico, limitando così l’esposizione del campione all’illuminazione LED.  

Un esempio è raffigurato in figura 1 nel quale cellule umane di osteosarcoma sono state infettate con un adenovirus. Il virus è stato ingegnerizzato geneticamente per esprimere GFP, dunque visualizzabile attraverso la fonte LED e l’opportuno filtro. Mentre il video olotomografico è stato ottenuto acquisendo un frame ogni 15 secondi, la fluorescenza è stata acquisita ogni 5 minuti. Grazie a questa configurazione è stato possibile visualizzare e seguire il fenotipo cellulare nel tempo, e verificare di tanto in tanto lo stato dell’infezione senza alterare significativamente il campione. Nello specifico, tale infezione conduce ad una chiara deformazione della membrana nucleare delle cellule infettate. Mentre le cellule non infettate presentano un nucleo con membrana “lineare”, le cellule infettate mostrano una membrana nucleare polilobata.

Figura 1: Frames di un esperimento in live-imaging prodotto con Nanolive utilizzando la linea cellulare U2OS (human bone osteosarcoma epithelial cells) infettate con adenovirus-GFP. Mentre l’acquisizione olotomografica dell’indice di rifrazione avviene ogni 15 secondi, la fluorescenza (GFP) viene acquisita ogni 5 minuti. La minor frequenza d’acquisizione della fluorescenza riduce notevolmente i danni indotti dall’irradiazione, ma consente di ottenere informazioni sufficienti riguardo l’avanzamento dell’infezione. Evidenti gli effetti causati dal virus al nucleo delle due cellule infettate, il quale mostra una membrana non sferica, ma lobata. Video gentilmente concesso dal Prof. Clodagh O’Shea del Salk Institute for Biological Studies (La Jolla, CA, USA). Video intero a questo link: NanoliveAdenovirus.

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