Nel nostro precedente articolo abbiamo conosciuto l’ultima novità digitale di Nanolive: il LIVE Cytotoxicity Assay (LCA1). Questo nuovo modulo d’analisi consente il riconoscimento e la quantificazione di cellule vive, apoptotiche e necrotiche in modalità label-free, combinato con la possibilità di quantificare il segnale a fluorescenza. La quantificazione della fluorescenza offre nuove possibilità d’analisi: la prima, descritta nel precedente articolo (LCA1), permette la distinzione di più popolazioni cellulari all’interno dello stesso pozzetto e l’analisi quantitativa di ognuna di esse.
Tuttavia, distinguere sotto-popolazioni non è l’unico vantaggio che la nuova funzionalità di LCA introduce. La quantificazione del segnale a fluorescenza avviene all’interno della cellula. Più precisamente, dopo aver estrapolato le maschere (i contorni) delle cellule dall’immagine olotmografica (dunque label-free), il software determina l’intensità della fluorescenza nei pixel all’interno della maschera. Questa modalità di quantificazione permette dunque la valutazione diretta di aumenti e/o diminuzioni di intensità intracellulari, molto utile per quanto riguarda esperimenti di uptake o di espressione genica. Infatti, utilizzando costrutti, composti, sistemi genetici o proteine opportunamente marcate, sarà possibile monitorare nel tempo le loro variazioni di fluorescenza intracellulare, correlandole direttamente con la loro espressione, uptake o produzione a seconda del sistema adottato.
In figura 1 abbiamo riportato un esempio di come poter sfruttare questa nuova funzionalità di Nanolive LCA (Figura 1). Nello specifico l’obiettivo dell’esperimento consiste nel testare l’espressione e l’efficienza di 4 mRNA terapeutici candidati. I 4 mRNA sono stati somministrati alle colture cellulari, le quali sono state osservate con Nanolive per 22 ore assieme ai pozzetti dedicati ai controlli (mock treated). In questo periodo, le cellule hanno iniziato ad assorbire i 4 mRNA, i quali, associati ad un reporter fluorescente, aumentavano il segnale fluorescente intracellulare quando espressi. Di conseguenza, oltre alla valutazione degli effetti dei trattamenti con l’olotomografia, è possibile monitorare il loro uptake ed espressione con la fluorescenza.
Combinando i dati di mortalità e segnale fluorescente è possibile determinare il miglior candidato in maniera immediata e affidabile (Figura 1D). Graficando la frazione delle cellule morte assieme all’intensità della fluorescenza è possibile correlare l’espressione (e uptake) dell’mRNA e i suoi effetti (Figura 2). Per esempio, in figura 2 è possibile notare come l’mRNA 4 viene fortemente assorbito nelle prime 8 ore generando un’altissima mortalità. Tuttavia, anche l’mRNA 2 conduce ad una mortalità comparabile, ma con un minor assorbimento. Pertanto, il candidato mRNA 2 si dimostra più efficiente rispetto al candidato mRNA 4. Per completezza, l’mRNA 1 viene assorbito con efficienza simile all’mRNA 2, ma induce effetti minori, mentre l’mRNA 3 risulta il meno efficiente sia in assorbimento che in mortalità.
