Optogenetica con Femtonics

Scoprire il contributo di ogni singolo neurone all’interno del sistema nervoso è il sogno di tutti i neuroscienziati. Districare i complessi circuiti neuronali rimane un’impresa titanica, ma l’avanzamento tecnologico ha consentito importanti passi avanti nell’analisi di questi network. Per esempio, la microscopia a 2 fotoni (Femtonics) ha permesso la visualizzazione di grandi volumi cerebrali in vivo grazie all’impiego di laser a infrarosso (IR) caratterizzati da un elevato potere penetrante e ridotta fototossicità. Un’ulteriore evoluzione tecnologica che ha contribuito fortemente allo studio dei network neuronali è l’optogenetica, ovvero la combinazione di tecniche ottiche e genetiche allo scopo di stimolare e registrare attività neuronali. La sola osservazione dei neuroni nella maggior parte dei casi fornisce dati insufficienti, di conseguenza è necessaria la combinazione di strategie complementari per collegare le varie attività registrate e dimostrare il nesso causale tra esse.

Grazie all’integrazione di due laser a infrarosso con un microscopio a due fotoni è possibile effettuare esperimenti di optogenetica (Figura 1). Con questa configurazione l’operatore è in grado di osservare e localizzare le attività neuronali, di stimolare specifiche aree e cellule, e dunque di correlarle tra esse. A rendere l’optogenetica ancora più vantaggiosa e efficacie è FEMTO 3D ATLAS, microscopio a due fotoni che, grazie alla tecnologia Acousto-Optic, consente l’acquisizione e la stimolazione di regioni tridimensionali. Infatti, a differenza dei sistemi convenzionali dove solamente aree bidimensionali possono essere visualizzate o stimolate, FEMTO 3D ATLAS permette di selezionare regioni con pattern a scelta, sia bidimensionali che tridimensionali. A seconda dei pattern selezionati, l’operatore potrà stimolare svariate cellule o processi dendritici in ampi volumi 3D con alta precisione. Attraverso un rapido “switch” tra i laser, la stimolazione verrà seguita istantaneamente dalla registrazione (circa 30us). FEMTO 3D ATLAS è dotato di un’altissima risoluzione temporale dell’ordine dei millisecondi, pertanto compatibile con le tempistiche di questi eventi biologici.

 

In Figura 2 è possibile apprezzare un esempio di esperimento di fotostimolazione effettuato con FEMTO 3D ATLAS. Nella corteccia cerebrale murina in analisi sono visibili in rosso i canali ChannelRhodopsin (Canali ionici fotosensibili) e in verde la calmodulina geneticamente modificata (Indicatore di Calcio). Il laser per la fotostimolazione eccita la channelrhodopsin espressa nelle cellule neurali presenti nei pattern pre-selezionati (quadrati in rosso), distribuendo omogeneamente l’energia sul soma dei neuroni al fine di ridurre danni da fototossicità. Per analizzare il potenziale di azione generato dalla stimolazione, un secondo laser viene impiegato per registrare l’intensità di “verde”, dunque l’attività di calcio (Figura 2B). Oltre a selezionare preventivamente le regioni di interesse (quadrati bianchi a linea continua e tratteggiata), con il software di Femtonics è possibile controllare precisamente le tempistiche di stimolazione e acquisizione. In questo modo, grazie alle modalità di FEMTO 3D ATLAS, è possibile esplorare le connessioni all’interno di network neurali correlandole tra esse.

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