Il SEM nel settore Food: alcuni casi studio
Introduzione
Negli ultimi decenni è stato riconosciuto l’enorme potenziale della microscopia elettronica per lo studio degli effetti dei parametri di lavorazione e degli ingredienti sulla struttura degli alimenti. I recenti sviluppi in questo campo hanno cambiato la nostra comprensione non solo delle strutture alimentari ma anche dei tipi di informazioni che ora ci si può aspettare di raccogliere riguardo alla struttura. La microscopia elettronica a scansione (SEM) è uno strumento molto utile per visualizzare la struttura degli alimenti, poiché rispetto alla microscopia ottica, permette di studiare sia le caratteristiche superficiali che quelle più interne, sfruttando un’ampia gamma di ingrandimenti e una profondità di campo circa 500 volte maggiore.
Negli ultimi anni lo studio della microstruttura degli alimenti ha assunto un’importanza sempre maggiore; la struttura interna degli alimenti può avere una profonda influenza sul loro valore nutrizionale, sulla reologia e sulla texture. Diversi processi di lavorazione degli alimenti, termici e non termici, possono alterare la struttura naturale e la composizione dei materiali alimentari, fino a provocare modifiche chimiche e fisiche che compromettono le proprietà organolettiche e riducono il contenuto o la biodisponibilità di alcuni nutrienti [1].
L’osservazione al SEM dei campioni alimentari
Tra i vantaggi dell’uso del SEM nell’analisi della struttura degli alimenti c’è una relativamente semplice preparazione del campione, benché i campioni alimentari abbiano caratteristiche chimico-fisiche (campioni non conduttivi e contenenti una certa percentuale di acqua) che ne limitano l’osservazione con le tecniche SEM convenzionali. Sono diverse le modalità con cui è possibile osservare un campione alimentare al SEM:
– Critical Point Drying. Il supercritical drying o critical point drying è un processo per rimuovere il liquido presente in un campione in modo preciso e controllato. Nell’analisi SEM convenzionale, i campioni alimentari idratati vengono fissati in una soluzione di glutaraldeide, disidratati con soluzioni a concentrazione via via crescente di etanolo, congelati rapidamente e fratturati a freddo. I frammenti vengono poi scongelati in etanolo assoluto e successivamente essiccati al punto critico, per poi essere infine metallizzati (generalmente con oro) prima dell’analisi al SEM. È stato tuttavia dimostrato che i campioni così preparati possono essere soggetti ad artefatti e contaminazioni provenienti proprio dallo strumento (Critical Point Dryer, o CPD) utilizzato per l’essiccazione [2].
– High Vacuum. La modalità di osservazione convenzionale in alto vuoto è utilizzabile su campioni già secchi o essiccati, preferibilmente usando basse tensioni di accelerazione per non danneggiare il campione. L’essiccazione è uno dei metodi più antichi ed economici per conservare cereali, frutta, verdura e alimenti di tutte le varietà. La qualità dei prodotti essiccati dipende fortemente dalle condizioni del processo di essiccazione. Come è stato dimostrato in moltissimi studi presenti in letteratura, varie caratteristiche importanti degli alimenti cambiano durante l’essiccazione a causa della perdita di umidità dalla struttura interna. La conoscenza della microstruttura è perciò importante per comprendere i meccanismi coinvolti durante l’essiccazione degli alimenti.
– Low Vacuum & ESEM (Environmental SEM). Le tecniche LV ed ESEM differiscono dal SEM convenzionale principalmente per la presenza di un gas all’interno della camera (aria, vapor d’acqua o altro gas). I campioni quindi non vengono osservati in alto vuoto, bensì in basso vuoto. Ciò è possibile grazie ad uno speciale design della colonna elettron-ottica che consente il pompaggio differenziale in diverse zone separate da opportuni diaframmi. Il gas svolge due ruoli principali. Il primo, comune sia ai sistemi ESEM che ai SEM operanti in Low Vacuum, è elettronico: il gas agisce come conduttore di carica elettrica evitando l’accumulo di carica sul campione. Il secondo ruolo, più specifico per i sistemi ESEM, è termodinamico: il gas è un mezzo condizionante, che impedisce l’evaporazione dei liquidi dal campione. Risulta così possibile eseguire osservazioni “dinamiche” su campioni allo stato naturale, ad esempio materiale idratato, utilizzando opportuni protocolli operativi che devono essere creati e sperimentati per ogni tipologia di campione, variando pressione, temperatura, energia e corrente del fascio primario all’interno della camera.
– Cryo-SEM. Con questa tecnica il campione viene congelato all’interno di una precamera, e viene poi immediatamente trasferito nella camera del microscopio per l’osservazione. La tecnica impiega azoto liquido per il raffreddamento del campione (-180°C), e solitamente prevede passaggi aggiuntivi, come la metallizzazione per migliorare la conduttività del campione. Il principale svantaggio della crio-microscopia resta il costo elevato del setup strumentale. Il metodo tuttavia fornisce una rapida fissazione fisica ed evita il rischio di introdurre artefatti tipici della fissazione chimica, come il restringimento o addirittura il collasso strutturale che talvolta si verificano con i metodi di preparazione convenzionali. Inoltre questa tecnica è particolarmente indicata per osservare campioni alimentari già congelati. Il congelamento è uno dei metodi più diffusi ed efficienti per la conservazione degli alimenti. Il passaggio chiave che determina l’efficienza del processo e la qualità del prodotto congelato è la transizione di fase in cui l’acqua si converte in ghiaccio attraverso la cristallizzazione. Nel congelamento degli alimenti, la formazione di cristalli di ghiaccio di grandi dimensioni, per lo più extracellulari, provoca notevoli danni ai tessuti, mentre la formazione di cristalli fini, distribuiti uniformemente sia all’interno che all’esterno delle cellule, porta ad una migliore salvaguardia della qualità del prodotto [3]. I cambiamenti strutturali associati al congelamento-scongelamento sono stati studiati in diversi tipi di tessuti, in cui è stato osservato come la velocità di raffreddamento e la temperatura finale raggiunta influenzino la microstruttura interna (Fig. 2, [4]).
– Cool Stage. Quando non è necessario congelare il campione fino a temperature di oltre -100°C, è possibile utilizzare uno speciale accessorio porta campioni dotato di cella Peltier, in grado di raffreddare il campione fino a -30°C. Questo accessorio consente di osservare sia campioni liquidi e semiliquidi (creme, paste), sia campioni solidi idratati. Il congelamento permette di preservare il campione sia dagli effetti dell’alto vuoto che dagli effetti del fascio elettronico. Il costo è relativamente basso se confrontato con la Cryo-SEM, l’accessorio può essere facilmente montato anche su un SEM tabletop e non sono richieste particolari preparative del campione.
Alcuni casi studio
1. Il Cioccolato
L’efflorescenza è la tendenza di alcuni composti a perdere acqua di cristallizzazione, cosicché i sali salgono sulla superficie formando dei depositi. L’efflorescenza del cioccolato (“chocolate bloom”) consiste in un rivestimento biancastro che appare sulla superficie e può essere di due tipi: efflorescenza del grasso o efflorescenza dello zucchero. L’efflorescenza non limita la durata di conservazione del cioccolato ma ne danneggia l’aspetto estetico e l’appetibilità, per questo è importante comprenderne i meccanismi di formazione e correlarli alle modalità di lavorazione e di conservazione del prodotto.
Diversi studi pubblicati in letteratura mostrano come sia possibile osservare il cioccolato al SEM avvalendosi delle diverse modalità sopra citate. In uno studio del 2008 [5], ad esempio, sono stati utilizzati sia l’ESEM che la Cryo-SEM per studiare la morfologia della superficie di cioccolato fresco e cioccolato “bloomed” (con le componenti zuccherina o grassa affiorate in superficie) e per osservare i cambiamenti in tempo reale durante il riscaldamento e il raffreddamento. Lo studio dimostra come le due tecniche siano complementari; nelle immagini ottenute la morfologia nodulare dell’efflorescenza degli zuccheri è facilmente distinguibile dai cristalli lamellari dell’efflorescenza dei grassi. In un altro studio del 2010 [6], invece, si utilizza la modalità Low Vacuum in un SEM equipaggiato con Cool Stage con una temperatura impostata di 5°C, con lo scopo di caratterizzare la superficie del cioccolato in diverse condizioni di conservazione.
Alcuni esempi di immagini ottenute utilizzando l’accessorio Cool Stage sulla superficie e in sezione di due diversi prodotti commerciali di cioccolato al latte sono riportati in Fig. 3.
2. Il Riso
Il riso novello, ovvero quello prodotto dai raccolti più recenti, ha un caratteristico aroma che è tipico di ciascuna qualità, aroma che viene parzialmente perso quando il riso invecchia nei magazzini di stoccaggio. La qualità del riso infatti tende a deteriorarsi all’aumentare del tempo di conservazione: la durezza del chicco aumenta, l’elasticità diminuisce e il gusto si altera. Questi cambiamenti sono strettamente correlati alle caratteristiche morfologiche e strutturali del chicco, come la forma e la disposizione delle cellule dell’endosperma, che rappresenta la parte principale del chicco ed è costituito da amido e proteine [7].
Osservando una sezione del chicco di riso novello al microscopio elettronico in alto vuoto a 10 kV (Fig.4-sx), è possibile vedere che le cellule prismatiche poligonali dalla forma allungata con grani di amido avvolti al loro interno, sono disposte a forma di ventaglio, con le cellule poste al centro di dimensione più piccola rispetto alle cellule più esterne.
Questa struttura radiale dell’endosperma è molto meno evidente nel chicco di riso invecchiato (Fig.4-dx). Un’immagine a maggiore ingrandimento sul tessuto centrale rivela che le cellule dell’endosperma, soprattutto quelle che si trovano nella parte centrale, risultano in parte spezzate, e con i granuli di amido più esposti.
Il film proteico sulla superficie delle cellule dell’endosperma è stato osservato ad alto ingrandimento (10000x). Come si può vedere in Fig.5-sx, nel chicco di riso novello il film proteico è intatto, mentre nel chicco di riso invecchiato (Fig.5-dx) il film proteico appare con uno spessore ridotto e presenta zone di rottura e diversi gradi di deformazione, con una conseguente maggior esposizione del granulo di amido interno.
Le cellule dell’endosperma del riso contengono amiloplasti singoli e complessi. Gli amiloplasti a grano singolo sono poliedri cristallini, spesso sotto forma di grani singoli con angoli smussati ed interstizi con gli amiloplasti circostanti che contengono principalmente regioni cristalline e amorfe formate da amilosio a catena lineare e ramificata. Gli amiloplasti a grani complessi sono di forma angolare, densamente disposti e strettamente legati agli amiloplasti circostanti. Gli studi hanno dimostrato che i granuli di amido nei chicchi di riso di alta qualità esistono principalmente sotto forma di amiloplasti complessi [8]. Osservando al SEM le cellule dell’endosperma del riso novello (Fig. 6), è possibile notare come i granuli di amido in questo campione di riso siano per lo più amiloplasti di tipo complesso, confermando l’alta qualità di questo riso.
3. Il Formaggio
Uno dei punti deboli di tutti i formaggi è sicuramente la tendenza a fare la muffa. Non esiste una sola ragione per cui il formaggio può ammuffire. Una causa comune è l’eccessiva umidità durante la conservazione del formaggio. L’uso di sacchetti o involucri di plastica, ad esempio, può trattenere troppa umidità. L’altra causa comune sono le variazioni di temperatura durante la refrigerazione. Nella maggior parte dei casi, il formaggio che ha sviluppato della muffa è ancora sicuro per il consumo, tant’è vero che molte muffe sono addirittura utilizzate proprio nella produzione di alcuni formaggi. Questo vale in linea di massima per i formaggi a pasta dura o semimolle, ma non vale per il formaggio fresco, come la mozzarella o la ricotta, che vanno consumati in breve tempo.
Sono diversi i funghi che vengono utilizzati nella produzione casearia: Penicillium glaucum, utilizzato nella produzione del Gorgonzola; Penicillium candidum (o Penicillium camemberti o Penicillium caseicola), utilizzato nella produzione dei formaggi Camembert e Brie; Penicillium roqueforti, utilizzato nella produzione dei formaggi Roquefort, Stilton e Danish Blue. Tutte queste specie hanno in comune una struttura piuttosto ramificata costituita da diversi conidiofori (i rami) con all’estremità un numero variabile di conidiospore di forma tondeggiante.
Utilizzando l’accessorio Cool Stage di Coxem è possibile osservare al SEM un campione di formaggio non conservato in maniera corretta, analizzandone una piccola porzione dopo averlo congelato all’interno della camera del microscopio alla temperatura di -25°C: le immagini acquisite con detector di elettroni secondari permettono di distinguere la tipica struttura ramificata di un fungo del genere Penicillium (Fig. 7). Non sempre però l’osservazione al SEM della morfologia e delle caratteristiche microscopiche di questi microorganismi è sufficiente per la loro corretta identificazione: a volte può essere necessario un sequenziamento del DNA.
4. La Farina di Grano
Il grano riveste una notevole importanza come cereale grazie al suo utilizzo diffuso in molti prodotti alimentari su scala globale. L’endosperma del frumento è composto principalmente da una matrice proteica in cui si trova l’amido (un polisaccaride), insieme ad una percentuale minore di lipidi.
La microscopia elettronica è un prezioso strumento di ricerca per esaminare la struttura del grano e dei suoi prodotti. Molti studi presenti in letteratura si sono concentrati sulla caratterizzazione e la comprensione delle proprietà sia dell’amido che della componente proteica, e di come queste influenzino il comportamento e la qualità di una farina e la sua attitudine alla panificazione.
In uno studio pubblicato nel 1999 [9], ad esempio, è stato osservato che gli amidi derivati da frumento, orzo e segale mostrano una distribuzione bimodale nelle dimensioni dei granuli. Nel caso del grano esistono due tipi distinti di granuli. I granuli di tipo B sono piccole particelle sferiche di dimensioni di circa 1-16 μm. I granuli di tipo A sono invece più grandi e di forma lenticolare, con dimensioni comprese tra 15 e 40 μm. È stato dimostrato che le proprietà fisico-chimiche dell’amido isolato da diverse varietà di grano variano a seconda del rapporto tra le frazioni A e B [10].
Per quanto riguarda invece la componente proteica, si utilizza il termine “glutine” per indicare un complesso costituito da due classi proteiche: Gluteline (chiamate glutenine nel grano) e Prolammine (chiamate gliadine nel grano). Le gliadine e le glutenine costituiscono circa l’80% dell’intera frazione proteica presente nell’endosperma della cariosside di frumento. Il rimanente 20% è costituito da altre due classi di proteine, che contrariamente alle precedenti sono solubili in acqua: Albumine (9%) e Globuline (5-7%). Nei semi di origine, le proteine che compongono il glutine hanno la funzione di nutrire l’embrione durante la germinazione; originariamente separate nell’endosperma della cariosside, si combinano insieme per formare glutine negli impasti a base di farina e acqua, ovvero un reticolo viscoelastico che conferisce agli impasti viscosità, elasticità e coesione. Nel momento in cui viene aggiunta acqua alla farina di grano, le gliadine (formate da un’unica catena proteica) cominciano ad associarsi formando delle fibrille (fibre piccole e sottili), che conferiscono estensibilità alla massa glutinica. Contemporaneamente, anche le glutenine (composte da diverse subunità proteiche) si assemblano, dando origine a fibre di dimensioni maggiori e formando una struttura, stabile e molto coesiva, che dona all’impasto consistenza e una certa resistenza all’estensione. Durante l’azione meccanica di impastamento, le fibrille di gliadina e le fibre di glutenina cominciano a intrecciarsi tra loro, formando una maglia tridimensionale (contenuto proteico 75-85%), che ingloba granuli di amido (10-15%), lipidi (5-10%), piccole quantità di sali minerali, acqua (che il glutine può trattenere fino al 70% del proprio peso) e bolle d’aria che, sono importantissime per la lievitazione e la panificazione. La quantità e la proporzione di gliadine e glutenine e il grado di integrità di queste proteine è un importante indice per valutare la qualità di una farina. Da alcuni studi è emerso come ad esempio il grano duro sia la tipologia di grano più adatta per la produzione di pasta [11, 12].
I campioni per l’osservazione al SEM venivano preparati quasi sempre secondo due diverse metodologie: o fissandoli in glutaraldeide e tetrossido di osmio e sottoponendoli a disidratazione graduale in etanolo ed essiccazione con Critical Point Dryer; oppure liofilizzandoli e fratturandoli per esporre le superfici interne, e successivamente applicando un sottile strato d’oro per mezzo di uno Sputter Coater.
Grazie all’accessorio Cool Stage è invece possibile osservare campioni di farina anche senza l’impiego di lunghe tecniche preparative. In Fig. 1 e in Fig. 8 sono riportate immagini di farina di grano tenero e di miscele farina-acqua in cui è possibile distinguere i granuli di amido e il reticolo viscoelastico costituito da fibre e fibrille.
Altre applicazioni del SEM nel settore Food
La microscopia elettronica a scansione consente varie modalità di osservazione dei materiali alimentari, e fornisce uno strumento affidabile sia per la ricerca e sviluppo sia per il controllo qualità nel settore Food, svolgendo un ruolo importante anche nei test di sicurezza alimentare e nelle analisi investigative forensi.
In particolare, il SEM abbinato alla spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDS) è uno strumento di analisi potente, spesso non distruttivo, per ottenere informazioni non solo sulla distribuzione dei materiali all’interno di una matrice, ma anche per l’identificazione di materiali inorganici (e alcuni organici) rilevati come contaminanti estranei nei prodotti alimentari restituiti dai consumatori o rilevati durante le ispezioni di controllo qualità negli impianti di produzione [13]. Con l’EDS è possibile ad esempio identificare un particolare tipo di acciaio o la composizione di un vetro esprimendo i risultati dell’analisi in % ossidi, confrontando gli spettri ottenuti con un database di materiali creato ad hoc per l’analisi comparativa.
Bibliografia
[1] Fazaeli, Mahboubeh & Tahmasebi, Maryam & Emam-Djomeh, Zahra. Characterization of food texture: application of Microscopic technology. In book: Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology (pp.855-871) Editors: A. Méndez-Vilas, 2012
[2] Larocque, Gisele and Yang, A. F. Critical Point Drier as a Source of Contamination in Food Samples Prepared for Scanning Electron Microscopy, Food Structure: Vol. 12: No. 1, Article 9; 1993.
[3] Kiani H, Sun DW. Water crystallization and its importance to freezing of foods: A review. Trends in Food Science and Technology. 2011; 22: 407-426.
[4] Delgado AE, Rubiolo AC. Microstructural changes in strawberry after freezing and thawing processes. Lwt-Food Science and Technology. 2005; 38: 135–142.
[5] Bryony J. James, Bronwen G. Smith, Surface structure and composition of fresh and bloomed chocolate analysed using X-ray photoelectron spectroscopy, cryo-scanning electron microscopy and environmental scanning electron microscopy, LWT – Food Science and Technology, Volume 42, Issue 5; 2009.
[6] Dahlenborg, H., Millqvist-Fureby, A., Bergenståhl, B. et al. Investigation of Chocolate Surfaces Using Profilometry and Low Vacuum Scanning Electron Microscopy. J Am Oil Chem Soc 88, 773–783; 2011.
[7] Xu M, Cheng W D, Cai X H, et al. Effect of storage on starch structure and content of rice. Chinese Agronomy Bulletin, 2005; 21(6):113-113.
[8] Fu Wenying, Xiang Yuanhong. Microstructure of endosperm of edible high-quality rice. Journal of Hunan Agricultural University: Natural Science Edition, 1997; 23(5):8.
[9] Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., & Chibbar, R. N. Separation and characterization of A- and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry, 1999; 76(3), 375–379.
[10] Rajesh Kumar, Narpinder Singh, Bhupendar Singh Khatkar Effects of A- and B-type starch granules on composition, structural, thermal, morphological, and pasting properties of starches from diverse wheat varieties, Food Bioengineering, 2023; Volume 2, Issue 4, Pages 373-383
[11] B.L. Dronzek, J.E. Dexter, R.R. Matsuo, A Scanning Electron Microscopy Study of Wheat Gluten, Canadian Institute of Food Science and Technology Journal, Volume 13, Issue 4; 1980.
[12] Dexter. J. E. and Matsuo. R. R. Influence of protein content on some durum wheat quality parameters. Can. J. Plant Sci. 57:717; 1977.
[13] Wayne D. Niemeyer, SEM/EDS analysis for problem solving in the food industry, Proc. SPIE 9636, Scanning Microscopies; 2015, 96360G
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