Introduzione
Uno dei dilemmi che attanaglia la comunità scientifica da decenni è sicuramente la classificazione dei virus: esseri viventi oppure entità biologiche? I virus sono patogeni obbligati costituiti da materiale genetico (DNA o RNA) racchiuso in una proteina chiamata capside, e talvolta anche da un involucro lipidico. Poiché non sono in grado di riprodursi autonomamente, non possono essere categorizzati come esseri viventi, ma a prescindere dalla loro classificazione, i virus sono tristemente celebri per le patologie da loro causate. Dall’herpes all’influenza, dall’AIDS al COVID, i virus godono di una pessima reputazione nell’immaginario collettivo. Nonostante la loro natura patogena però, a partire dal ventesimo secolo gli scienziati hanno iniziato a notare che alcune caratteristiche uniche li rendevano estremamente utili come strumenti di ricerca.
Figura 1: A. I primi ad ottenere un’immagine di un virus furono Kausche G. A., Pfankuch E., Ruska H. nel 1939 [1]. Nello specifico, isolarono il virus del tabacco e lo visualizzarono con un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). B. Lo stesso tipo di virus acquisito con LVEM25 di Delong Instruments, un TEM a basso voltaggio, adatto per la visualizzazione di campioni biologici.
Il ruolo dei virus nella ricerca scientifica è fondamentale e ha avuto un impatto significativo su numerosi campi, dalla biologia molecolare alla medicina, dalla genetica all’immunologia. I virus sono diventati strumenti potenti per la comprensione dei processi biologici e per lo sviluppo di nuove terapie e tecnologie. La ricerca sui virus ha non solo ampliato le nostre conoscenze sul funzionamento del sistema immunitario, ma ha anche permesso progressi nella genetica, nella biotecnologia e nelle neuroscienze. Inoltre, la loro struttura estremamente semplice li rende modelli ideali per studiare i meccanismi biologici di base, come la replicazione del DNA, la sintesi proteica e la risposta immunitaria.
Da patogeni letali a utili strumenti, i virus caratterizzano la nostra vita e il mondo della ricerca. In questa application note, analizzeremo i virus da 3 punti di vista differenti: una modalità per visualizzarli, una modalità per utilizzarli e una modalità per studiarli (Figura 2).
Figura 2: Tabella riassuntiva delle tre modalità descritte nell’application note.
Visualizzazione: microscopia elettronica a trasmissione
L’esistenza dei virus venne ipotizzata da Dmitri Ivanovski, botanico russo che nel 1892 scoprì che la diffusione della malattia del mosaico del tabacco non veniva bloccata dai filtri anti-batterici. I virus infatti, sono di dimensioni inferiori dei batteri e ciò, oltre a consentirne il passaggio attraverso i filtri, rende la loro visualizzazione estremamente complessa. La conferma della loro esistenza arrivò solamente nel 1935, quando Stanley W. M. riuscì a cristallizzarlo e nel 1939 quando Kausche G. A., Pfankuch E. e Ruska H. visualizzarono per la prima volta una particella virale. Negli anni 30 infatti, la nascita della microscopia elettronica a trasmissione aprì un capitolo fondamentale nella virologia. L’introduzione del TEM non solo permise di osservare la morfologia dei virus, ma aprì anche nuove opportunità per comprendere il loro ciclo di vita, la loro composizione e la loro interazione con le cellule ospiti. Negli anni successivi, numerosi virus, tra cui il poliovirus, il virus dell’epatite, il virus dell’influenza e altri, furono studiati grazie al TEM, rivelando la loro varietà di forme e strutture. Queste scoperte hanno avuto un impatto cruciale sulla medicina, poiché hanno permesso agli scienziati di sviluppare vaccini e trattamenti contro malattie virali.
Il vantaggio della microscopia elettronica a trasmissione è l’altissima risoluzione. Il TEM permette di osservare in dettaglio la struttura virale, determinarne la forma, dimensioni e composizione. Inoltre, il TEM è utilizzato per osservare come i virus interagiscono con la cellula ospite, durante l’entrata, la replicazione e il rilascio. Ovviamente, anche lo studio delle cellule e tessuti infettati è possibile utilizzando il TEM, sia in contesti di ricerca che di diagnostica.
Un microscopio elettronico a trasmissione particolarmente adatto alla visualizzazione di campioni biologici è LVEM25 di Delong Instruments. Questo TEM lavora a basso voltaggio e si presta alla visualizzazione di campioni biologici in quanto richiede una ridotta preparativa della sezione. Alcuni esempi, sono riportati in Figura 1 e Figura 3.
Figura 3: Immagini TEM acquisite con LVEM25 di Delong Instruments. Nello specifico è possibile notare 4 tipologie virali in 3 differenti ingrandimenti. In tutti e 3 i casi, le particelle virali sono state isolare, marcate e depositate su carbon film.
Utilizzo: i virus come sonde fluorescenti e non solo
La capacità dei virus di penetrare le cellule in maniera specifica e di diffondersi velocemente incuriosì gli scienziati, i quali, non solo compresero la gravità potenziale del patogeno, ma intravidero grandi potenzialità tecnologiche. Ad oggi, i virus sono tool molto utilizzati in biologia, principalmente come vettori. Ingegnerizzando i virus infatti, è possibile aggiungere geni di interesse al materiale genetico del virus e trasferirlo alle cellule dell’ospite in maniera specifica. Questa strategia consente di far esprimere specifiche proteine a specifiche cellule, aprendo numerose opportunità. Dalla terapia genica alla marcatura fluorescente, i virus vengono sfruttati quotidianamente dai ricercatori in svariati campi.
Un esempio molto elegante, è riportato nel paper Jacobsen et al., dove un gruppo di neuroscienziati ha utilizzato sapientemente le caratteristiche uniche dei virus per marcare specificatamente dei neuroni e le loro connessioni (2). Nello specifico, hanno sviluppato un metodo per marcare specifici neuroni usando due adeno-associated virus (AAV) e un virus della rabbia modificato.
Per targetizzare singole cellule in specifiche aree dell’ippocampo e identificare i loro input monosinaptici nel cervello in vivo, hanno inizialmente effettuato un’iniezione intrauterina di un virus che trasporta la Cre ricombinasi per ottenere un’espressione sparsa di Cre nel cervello adulto. Successivamente, hanno iniettato localmente (dunque nel cervello) un helper virus in grado di funzionare solamente in presenza della Cre ricombinasi, dunque in grado di esprimere le proteine di interesse solamente nei rari neuroni Cre+ ottenuti nello step precedente. Queste proteine di interesse consistono in un recettore di membrana e in una G-Protein, necessari per l’infezione e la diffusione. Oltre a queste due proteine è stato inserito anche un marcatore a fluorescenza (detto Helper Tag), in modo da visualizzare al microscopio le cellule modificate che in questo caso vengono definite Starter Cells (Figura 4).
Dopo aver modificato e marcato le Starter Cells, i ricercatori hanno iniettato localmente un terzo virus, il quale è in grado di infettare solamente le Starter Cells (in quanto esprimono il recettore e la G-protein) e di diffondersi nei neuroni ad essa collegati. In questo modo, grazie ad una seconda marcatura a fluorescenza (GCaMP6f), otterremo la marcatura delle Input Cells, ovvero i loro input monosinaptici.
In conclusione, grazie al sapiente utilizzo di 3 virus ricombinati, i ricercatori sono riusciti ad ottenere singoli neuroni marcati (doppio colore, Helper Tag e GCaMP6f) e i le loro connessioni monosinaptiche (solo GCaMP6f) (Figura 4).
Figura 4: Rappresentazione schematica della strategia virale applicata nell’esperimento di Jacobsen et al. Dopo una prima iniezione a livello intrauterino con un virus portante Cre, l’helper virus (verde) e il virus della rabbia modificato (viola) vengono iniettati a livello locale (cervello). Mentre l’helper virus infetterà solamente i neuroni in possesso della Cre ricombinasi (precedentemente iniettata) e genererà le Starter Cells (verdi), il virus della rabbia infetterà le Starter Cells e darà origine alle Input Cells (viola), ovvero diffondendosi nei neuroni connessi.
Una volta ottenute le marcature, il modello è stato visualizzato utilizzando un microscopio a 2 fotoni Femtonics, FEMTO SMART. Questo sistema multifotone consente di penetrare tessuti in senza danneggiare l’animale e dunque di valutare l’attività dei neuroni in vivo. In Figura 5 è possibile notare, oltre ad uno schematico riassunto della strategia di iniezione, due immagini suggestive dei neuroni marcati. Nello specifico, le Starter Cells appaiono in verde (Helper Tag) e le Input Cells in viola (GCaMP6f): i neuroni così marcati sono stati utilizzati per registrare le loro attività di calcio e studiare le interconnessioni neuronali.
Figura 5: Riassunto della strategia utilizzata per marcare i neuroni e le loro connessioni. Nelle due figure ottenute con microscopio a 2 fotoni FEMTO SMART è possibile notare il risultato della marcatura direttamente in corteccia in vivo.
Studio: effetti citopatici in real-time
La virologia non consiste solamente nella descrizione dei virus, ovviamente, gran parte degli sforzi dei virologi è dedicata allo studio degli effetti virali su cellule, tessuti e organismo, al fine di trovarne una cura. Per valutare i meccanismi e gli effetti di un determinato virus, ci sono numerosi approcci: uno di questi è la microscopia. In questo caso il focus non sarà la particella virale, ma l’ospite, sia esso una cellula, un tessuto o un organismo.
Un esempio di studio di meccanismo virale molto interessante, arriva dal Virus and Immunity lab del prestigioso Pasteur Institute di Parigi. Tra i processi d’interesse del Prof. Schwartz troviamo la virus-driven cell-cell fusion, ovvero la formazione di cellule multinucleate causata dall’infezione virale. La fusione tra cellule è un processo che avviene nel nostro corpo in condizioni fisiologiche per determinati processi, come la rigenerazione muscolare, la risposta immunitaria o la fecondazione. La cell-cell fusion indotta da un’infezione virale però è da considerarsi patologica. I virus possiedono principalmente due modalità di trasmissione tra cellula a cellula. Generalmente, la diffusione di un virus avviene tramite rilascio di particelle virali dalla cellula infettata che diffondono fino a trovare una nuova cellula target. D’altro canto, molti virus possono propagarsi in altre cellule senza diffondere nello spazio extra-cellulare, inducendo appunto la fusione della cellula infettata con altre sane.
Per affrontare lo studio di questo nuovo virus, Schwartz ha selezionato l’imaging label-free di Nanolive, in quanto rappresenta una strategia completa e unbiased per ottenere risultati robusti velocemente (Nanolive). Grazie all’olotomografia di Nanolive è possibile seguire il fenotipo cellulare nel tempo acquisendo informazioni sia a livello subcellulare che di popolazione. È stato sufficiente un semplice esperimento di confronto tra cellule infettate da SARS-CoV-2 e cellule controllo per osservare cambiamenti fenotipici sorprendenti. Sebbene la cell-cell fusion non sia una strategia di diffusione comune tra i virus della famiglia dei Coronaviridae, le cellule infettate da SARS-CoV-2 formarono un enorme sincizio nell’arco di 10 ore portando alla luce un’importante informazione riguardo la modalità di trasmissione del virus (Figura 6).
Figura 6: Frames di un esperimento in live-imaging prodotto con Nanolive (1 immagine ogni 10 minuti per 20 ore). Mentre le cellule nel campione di controllo proliferano, le cellule infettate con SARS-CoV-2 iniziano a fondere tra di loro formando un’unica grande cellula multinucleata. Il primo evento di cell-cell fusion avviene attorno alla sesta ora di registrazione innescando una reazione a catena che porta alla generazione del sincizio in poche ore. Video intero a questo link https://www.youtube.com/watch?v=kKaPtte1rwY.
Conclusione
Sebbene i virus siano spesso visti sotto una luce negativa a causa della loro patogenicità, il loro studio ha aperto numerose porte alla scienza. La ricerca sui virus ha portato alla scoperta di principi fondamentali della biologia, ha permesso il miglioramento delle tecniche di trattamento e diagnosi e continua a offrire nuove opportunità per l’innovazione in molti settori della medicina e della biotecnologia. In questa application note abbiamo analizzato tre metodologie molto differenti, nelle quali i virus e la microscopia giocano un ruolo centrale.
(1) Kausche GA, Pfankuch E, Ruska H. Die Sichtbarmachung von pflanzlichem Virus im Übermikroskop. Naturwissenschaften. 1939;27:292–299. doi: 10.1007/BF01493353.
(2) Jacobsen RI, Nair RR, Obenhaus HA, Donato F, Slettmoen T, Moser MB, Moser EI. All-viral tracing of monosynaptic inputs to single birthdate-defined neurons in the intact brain. Cell Rep Methods. 2022 May 23;2(5):100221. doi: 10.1016/j.crmeth.2022.100221. PMID: 35637903; PMCID: PMC9142754.