Nei nostri precedenti articoli abbiamo descritto l’ultima novità digitale di Nanolive: il LIVE Cytotoxicity Assay (LCA1 e LCA2). Questo nuovo modulo d’analisi consente il riconoscimento e la quantificazione di cellule vive, apoptotiche e necrotiche in modalità label-free, combinato con la possibilità di quantificare il segnale a fluorescenza. La quantificazione della fluorescenza offre nuove possibilità d’analisi, come la distinzione di più popolazioni cellulari all’interno dello stesso pozzetto e l’analisi quantitativa di ognuna di esse (LCA1) oppure la quantificazione dell’espressione di mRNA (LCA2). In questo articolo, andremo a descrivere un ulteriore vantaggio introdotto dalla nuova funzionalità del software Nanolive.
La quantificazione del segnale a fluorescenza avviene all’interno della cellula. Più precisamente, dopo aver estrapolato le maschere (i contorni) delle cellule dall’immagine olotomografica (dunque label-free), LCA determina l’intensità della fluorescenza nei pixel all’interno della maschera. Questa modalità di quantificazione permette dunque la valutazione diretta di aumenti e/o diminuzioni di intensità intracellulari, molto utile per quanto riguarda esperimenti di uptake o di espressione genica. Nello scorso articolo, abbiamo descritto come è possibile monitorare l’espressione di mRNA attraverso l’utilizzo di mRNA con reporter a fluorescenza.
In questo articolo invece, riportiamo un esempio di Uptake quantification, ovvero un esperimento nel quale viene misurata l’internalizzazione di nanoparticelle nel tempo.
In questo esperimento sono state utilizzate nanoparticelle coniugate con un fluoroforo sensibile al pH (Figura 1A). Una volta internalizzate per fagocitosi tali bioparticelle iniziano ad emettere fluorescenza a causa di un cambio conformazionale dovuto al pH acido dei fagosomi (Figura 1B). La quantificazione del loro uptake diventa immediata con LCA: il software estrapolerà le maschere di ogni singola cellula (i contorni) e quantificherà l’intensità del segnale fluorescente all’interno di esse. In figura 1C è possibile apprezzare un frame dell’esperimento in tima-lapse: in scala di grigi si può notare la popolazione cellulare, mentre in rosso le nanoparticelle internalizzate. Nello zoom osserviamo in dettaglio tutti e 3 gli stati delle nanoparticelle coniugate: grigie quando fuori dalla cellula, rosse quando internalizzate, ma anche grigie all’interno del fagosoma appena formato (dunque destinata a diventare rossa) (Figura 1C).
