Vita, morte e un miracolo

I test di vitalità sono esperimenti molto comuni e impiegati per determinare la sopravvivenza e la mortalità di una determinata coltura cellulare. Applicati in vari campi di ricerca, questi test sono spesso utilizzati per misurare lo stato di salute cellulare in risposta a stimoli extracellulari, agenti chimici o trattamenti terapeutici. Infatti, questi esperimenti permettono di effettuare screening di composti al fine di determinarne l’effetto sulla proliferazione, metabolismo o morte cellulare.

Vitalità e mortalità cellulare possono essere individuate e quantificate sulla base di caratteristiche morfologiche, metaboliche o molecolari. Solitamente, le tecniche convenzionali prevedono un approccio semplicistico per definire la vitalità cellulare, andando a quantificare il numero di cellule vive o morte. Questi esperimenti sono spesso end-point assay caratterizzati dall’impiego di staining a fluorescenza, dunque limitati all’analisi di un singolo time point. Di conseguenza, tali approcci impediscono l’investigazione delle dinamiche della mortalità cellulare nel tempo. Una soluzione a questo limite è rappresentata da esperimenti in time-lapse. Esistono infatti coloranti adatti al live imaging, i quali però generano inevitabilmente danni da fototossicità con conseguente alterazione del risultato.

La soluzione definitiva è rappresentata dal live imaging label-free di Nanolive (per approfondimenti ApplicationNote). Registrare video di colture cellulari senza l’impiego di marcatori cellulari permette di ottenere informazioni sulle dinamiche cellulari nel corso dell’intero esperimento senza alterare il campione. Inoltre, le immagini prodotte dall’olotomografia di Nanolive sono ricche di informazioni su vari livelli; in ogni video è infatti possibile seguire con precisione dinamiche di popolazioni cellulari, ma anche morfologia e dettagli subcellulari di ogni singola cellula (Figura 1).

Figura 1: Frames di un video prodotto con Nanolive CX-A nel quale è possibile notare due eventi di morte cellulare per apoptosi in momenti differenti.

L’imaging unbiased e multiplexed di Nanolive fornisce un’opportunità unica per lo studio della vitalità cellulare sia dal punto di vista dell’imaging, ma anche dell’analisi. Infatti, Nanolive ha recentemente sviluppato un software di analisi dedicato ai test di vitalità e mortalità. Il Live Cell Death Assay (LCDA) è la prima soluzione digitale che, con un semplice click, estrapola informazioni complete riguardo vitalità e mortalità cellulare da esperimenti time-lapse interamente label-free. Inoltre, grazie all’impiego dell’intelligenza artificiale, LCDA non solo riconosce e quantifica cellule vive e morte, ma discrimina anche eventi di apoptosi e necrosi. Una volta identificata una cellula morta, LCDA calcola la probabilità che la morte sia avvenuta in maniera programmata (apoptosi) oppure accidentale (necrosi) (Figura 2).

Figura 2: Rappresentazione schematica di un’analisi LCDA. Le cellule vengono segmentate e 320 caratteristiche vengono calcolate (dalla morfologia al contenuto cellulare). LCDA confronta questi 320 descrittori con le caratteristiche delle cellule apoptotiche e necrotiche imparate dal machine learning. Terminato il confronto, LCDA assegna ogni cellula ad una categoria con una percentuale di confidenza. Ciascuna cellula riceve dunque 3 probabilità (una per categoria) per ogni time-point: la probabilità più alta determina la categoria di appartenenza e dunque il colore con cui è mostrata. Una volta classificate, LCDA quantifica il numero di oggetti per categoria e calcola tutti i parametri elencati in figura 3.

LCDA è stato allenato con machine learning utilizzando specifici cambiamenti morfologici del citoscheletro per distinguere apoptosi da necrosi, e ulteriori 300 parametri per discriminare cellule vive o morte. Ogni singola cellula viene analizzata e per ognuna viene calcolata la probabilità di appartenere ad una delle tre categorie: living, apoptotic o necrotic. Tale probabilità rappresenta un utile indicatore di stress, in quanto il valore di mortalità aumenta quando la cellula sperimenta condizioni non fisiologiche. Inoltre, è opportuno sottolineare che, a differenza delle tecniche convenzionali, il continous imaging di Nanolive consente di acquisire dati anche sulle dinamiche e tempistiche di questi eventi, arricchendo i risultati ottenibili.

Figura 3: Overview dei parametri e delle maschere calcolate e prodotte da LCDA. Per ogni esperimento l’operatore otterrà tutti i parametri nell’elenco e potrà selezionare qualche classificazione applicare all’esperimento.

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