È pressoché inutile sottolineare l’importanza delle piante nel nostro pianeta dato che tutti siamo consapevoli del loro ruolo essenziale nella nostra vita. Lo stretto legame tra uomo e vegetali nasce all’alba dei tempi con la botanica, la scienza più antica del mondo. Da millenni l’uomo ha studiato le piante per nutrirsi e curarsi, ma negli ultimi secoli gli organismi vegetali hanno giocato un ruolo fondamentale anche a livello scientifico. Dalla genetica classica nata dalle osservazioni di Mendel e le sue piante di pisello, al Crossing-Over tra cromatidi estrapolato da uno studio sul mais della McClintok, le piante sono state modelli di studio essenziali per numerose scoperte genetiche e molecolari trasferibili a tutti gli esseri viventi.
Tra le varie tecniche adottate in biologia vegetale per lo studio delle piante è presente anche la microscopia. Seppur caratterizzate da una spessa parete cellulare, le cellule vegetali possono essere osservate facilmente anche senza colorazioni con un microscopio ottico. Ad ogni modo, la visualizzazione di dinamiche cellulari e subcellulari più complesse e in compartimenti più profondi della pianta richiede una tecnologia più avanzata. L’avvento della microscopia confocale ha dato un forte contributo nell’ambito vegetale, dove è stato possibile visualizzare ad alta risoluzione componenti e dinamiche cellulari fino ad allora inesplorate.
Purtroppo però la microscopia confocale è caratterizzata da alcuni limiti. L’utilizzo di laser nello spettro visibile genera riscaldamento e dispersione della luce nella zona analizzata, con conseguenti danni da phototoxicity e photobleaching del tessuto. Una valida alternativa è rappresentata dalla – nella quale l’implementazione di laser a infrarosso riducono notevolmente i danni da phototoxicity e forniscono un potere penetrante maggiore.
Un esempio dell’applicabilità di questa tecnologia in botanica è lo studio dei movimenti dei cloroplasti, tipici organelli delle cellule vegetali (Figura 1). Al loro interno si svolge la fotosintesi clorofilliana, reazione che porta alla produzione di glucosio e ossigeno a partire da acqua e anidride carbonica. L’ingrediente segreto di questa reazione chimica è però la luce solare, la quale viene assorbita selettivamente da pigmenti come la clorofilla e scatena la reazione fotosintetica.
Figura 1: Cloroplasti sulla superfice di una foglia di rucola (Eruca sativa). L’immagine è stata ottenuta con FEMTO SMART in modalità Galvo sfruttando l’autofluorescenza del tessuto.
Catturare l’energia solare è dunque essenziale per gli organismi vegetali, i quali nel corso dell’evoluzione hanno sviluppato efficaci sistemi di regolazione per assicurarsi un corretto assorbimento di luce solare. Infatti, non solo è importante assorbire sufficiente luce solare per mantenere l’organismo in vita, ma anche evitare l’eccessiva irradiazione per evitare danni foto-ossidativi. In presenza di scarsa illuminazione, i cloroplasti si distribuiscono nella zona apicale della cellula ampliando la superficie di assorbimento, mentre in casi di forte luce gli organelli si disporranno sulle pareti laterali, riducendola (Figura 2).
Figura 2: La distribuzione dei Cloroplasti all’interno della cellula in condizioni di scarsa (A) o forte (B) illuminazione.
Visualizzare questi movimenti è importante per comprendere la velocità con cui la pianta risponde agli stimoli luminosi. La microscopia a 2 fotoni si presta perfettamente a questo compito in quanto garantisce alta risoluzione e alto contrasto, senza disturbare gli organelli. Tale studio infatti può essere effettuato anche con un microscopio confocale, ma i laser utilizzati interferirebbero con i cloroplasti (danni foto-ossidativi, riscaldamento e simulando gli effetti della luce solare) alterando il risultato.
In questo articolo, presentiamo un in vivo live imaging condotto da FEMTONICS con uno dei suoi microscopi a 2 fotoni: FEMTO SMART. SMART è un sistema multifotone dotato di scanner sia galvanometrici che risonanti e caratterizzato da un ampio spazio sotto l’obiettivo permettendo l’imaging di qualsiasi organismo modello. Ad ogni modo, in questo esperimento l’estesa disponibilità spaziale non è servita, in quanto è stata utilizzata una semplice foglia di rucola (Eruca sativa). Acquisendo un corto time-lapse video di 30 minuti è stato possibile osservare i cloroplasti sulla superficie della foglia ed alcuni dei loro movimenti subcellulari (Figura 3).
