Prendi la mira con Femtonics: strategie per ottenere il perfect focus con un 2 fotoni. (Parte 2)

Nel nostro precedente articolo (che puoi leggere a questo link: https://www.linkedin.com/pulse/prendi-la-mira-con-femtonics-parte-1-media-system-lab-s-r-l-) abbiamo introdotto alcune soluzioni per la ricerca del piano focale con microscopi a 2 fotoni. Nello specifico, abbiamo trattato una serie di moduli specifici di FEMTO SMART (microscopio a 2 fotoni dell’azienda Femtonics), i quali miglioravano la flessibilità del sistema aumentando le possibilità di trovare il Field of View (FOV) desiderato in qualsiasi tipo di campione. Avevamo lasciato in sospeso la seconda soluzione proposta da Femtonics, che ora, tratteremo di seguito. La seconda soluzione proposta da Femtonics è racchiusa nella tecnologia unica di FEMTO 3D ATLAS. Tale microscopio utilizza l’Acousto-Optic Technology, sistema innovativo che attraverso cristalli di diossido di tellurio orienta il laser a 2 fotoni con elevata precisione e velocità ottenendo un’immagine 3D. FEMTO 3D ATLAS non necessità dunque di sistemi motorizzati in X, Y o Z: una coppia di cristalli controlla i movimenti del laser in XY, mentre una seconda coppia i movimenti in Z. A differenza del tradizionale raster-scanning (tipico dei 2 fotoni convenzionali), FEMTO 3D ATLAS acquisisce una regione 3D del campione aumentando il potere di investigazione e agevolando la ricerca del piano focale. Infatti, ottenendo una regione tridimensionale è possibile selezionare via software uno specifico piano focale in qualsiasi orientamento e direzione. Tale vantaggio è messo in atto con l’High-Speed Arbitrary Frame scanning, funzione del software di Femtonics che permette di posizionare arbitrariamente il FOV all’interno della regione 3D acquisita (Figura 1). Questa modalità, per esempio, garantisce ai neuroscienziati di trovare il miglior piano focale per assoni o dendriti d’interesse, i quali molto spesso si trovano distribuiti nello spazio in maniera irregolare o imprevedibile.

Figura 1: A sinistra la rappresentazione grafica del posizionamento del FOV (rosa) all’interno della regione 3D in acquisizione (parallelepipedo bianco). A destra le immagini dello stesso circuito neuronale ottenute a diverse angolazioni.

I vantaggi dell’Acousto-Optic Technology non si limitano all’High-Speed Arbitrary Frame scanning, ma forniscono un’ulteriore modalità d’acquisizione grazie ad una seconda funzione software. Questa funzione viene detta Region Scanning e consiste nella preselezione, all’interno della regione 3D, di specifiche aree o volumi d’interesse. In questo modo, è evidente che l’operatore avrà la pressoché totale libertà di posizionare il FOV nel miglior orientamento possibile. Linee, superfici, parallelepipedi o cubi; svariate sono le forme disponibili con le quali è possibile selezionare strutture d’interesse distribuite nello spazio tridimensionale del campione (Figura 2). Questo tool è particolarmente adatto allo studio di circuiti neuronali o attività di specifici neuroni, il cui studio non può prescindere dalla loro struttura 3D.

Figura 2: Rappresentazione grafica delle varie modalità di acquisizione con Region Scanning.

Una volta trovato il piano focale di nostro gradimento i problemi purtroppo non finiscono. Infatti, se pensiamo ad un esperimento in vivo, è pressocché inevitabile che l’organismo in analisi si muova alterando l’immagine. Nonostante l’eventuale anestesia, l’animale presenta un battito cardiaco e una respirazione basale, i quali generano movimenti che, seppur microscopici, possono far perdere il fuoco sulla struttura d’interesse. Per superare questo ostacolo Femtonics applica una Live Anti-Motion Correction alle sue immagini; grazie a una correzione software infatti le immagini acquisite con FEMTO 3D ATLAS vengono stabilizzate eliminando ogni forma di vibrazione o aberrazione. Tale funzione è resa possibile ancora una volta dalla tecnologia Acousto-Optics, la quale, acquisendo informazioni attorno alla regione di interesse, garantisce al software informazioni sufficienti per correggere eventuali vibrazioni o movimenti.

L’impiego di campioni tridimensionali o di organismi modello aumenta inevitabilmente la difficoltà di imaging, ma esistono varie strategie per agevolare la ricerca del FOV d’interesse con diverse angolazioni e profondità. Dai moduli meccanici di FEMTO SMART all’Acousto-Optic di FEMTO 3D ATLAS, Femtonics propone due efficaci soluzioni in grado di soddisfare le esigenze di ogni ricercatore per ogni specifica applicazione.

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