Quanto tempo impieghiamo a mettere a fuoco i nostri campioni? Trovare il focus perfetto con un microscopio può essere un processo lento e laborioso, soprattutto quando si utilizzano campioni spessi, tridimensionali o addirittura vivi. L’impiego di campioni di questo genere è molto comune quando si tratta di microscopia a 2 fotoni. Infatti, come descritto in maniera dettagliata nella nostra application note (AppNoteNeurone), i sistemi multifotone si prestano perfettamente a questa tipologia di imaging grazie al loro alto potere penetrante e ridotta fototossicità. Campioni complessi aumentano inevitabilmente la difficoltà di imaging, sia dal punto di vista della qualità dell’immagine, ma anche dell’orientamento e focus. Prendendo per esempio un classico esperimento al 2 fotoni come l’imaging dell’attività neuronale nella corteccia cerebrale di topo, è facile immaginare che l’orientamento del campione, e di conseguenza anche degli strati cerebrali, sia imprevedibile e probabilmente irregolare. Esistono varie strategie per agevolare la ricerca del piano focale perfetto nella microscopia multifotone; in questo articolo vi presenteremo due soluzioni proposte da Femtonics, azienda specializzata nella produzione di microscopi a 2 fotoni.
La prima soluzione è rappresentata da una serie di moduli esclusivi di FEMTO SMART. Questo microscopio è un sistema a 2 fotoni convenzionale che attraverso scanner galvanometrici o resonant scansiona il piano focale e ottiene un’immagine 2D. L’ampio spazio sottostante l’obiettivo di questo strumento agevola il posizionamento del campione, sia esso in vitro o in vivo. Oltre ai sistemi motorizzati integrati nel microscopio (i quali permettono il movimento dell’obiettivo in XY e in Z), FEMTO SMART può essere integrato con moduli opzionali che migliorano notevolmente la capacità di trovare il focus perfetto. Il modulo più adatto per la ricerca del Field of View (FOV) migliore è senza dubbio la tilting objective unit, sistema motorizzato che permette di ruotare e inclinare l’obiettivo per un’elevata libertà di posizionamento e la possibilità di visualizzare il campione da differenti angolazioni (Figura 1). Con 180° di rotazione sull’asse orizzontale e 100° sull’asse verticale, la tilting objective unit consente di trovare con precisione il FOV d’interesse senza maneggiare o muovere il campione (Figura 2A). La flessibilità e precisione dell’obiettivo così configurato permette di raggiungere anche regioni cerebrali laterali o di seguire dettagliatamente la traiettoria di assoni e dendriti.
Ad aumentare ulteriormente la libertà di movimento dell’obiettivo è il Piezo Objective Positioner, modulo che consente il movimento dell’obiettivo sull’asse Z con alta precisione e velocità (rispetto alla Z motorizzata standard già integrata). Femtonics propone due tipi di Piezo Objective Positioner: il primo con 400µm di corsa fino a 30Hz, il secondo con una corsa ridotta a 100µm, ma più veloce (100Hz). Il Positioner non solo facilita la ricerca del piano focale in Z, ma risulta adatto all’acquisizione di volumi 3D. Infatti, FEMTO SMART equipaggiato con Piezo Objective Positioner è in grado di acquisire immagini a differenti profondità ad una velocità sufficiente per catturare attività biologiche in volumi 3D. Inoltre, se integrato con un apposito modulo software, Piezo Objective Positioner permette di seguire traiettorie specifiche con alta precisione, come ad esempio dendriti o assoni (Figura 2B e C).
L’ampio spazio sotto l’obiettivo, la Tilting Objective Unit e il Piezo Objective Positioner; insieme queste caratteristiche conferiscono grande flessibilità e versatilità per campioni 3D e organismi modello. Ad ogni modo, quando grandi organismi modello (mammiferi e primati non-umani) vengono utilizzati, i 36cm sotto l’obiettivo di FEMTO SMART possono risultare insufficienti. In questi particolari casi, FEMTO SMART può essere integrato con il Bridge, un ulteriore modulo che aumenta notevolmente lo spazio sottostante l’obiettivo assicurando il posizionamento di qualsiasi organismo modello (Figura 3). Bridge è una struttura flessibile che consente il movimento della scanhead di 46cm in verticale (per un massimo di 50cm) e compatibile sia con la Tilting Objective Unit e il Piezo Objective Positioner.
La seconda soluzione proposta da Femtonics è…
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