L’immunoterapia è una delle strategie più innovative e promettenti nella ricerca contro il cancro. Tale approccio si basa su differenti metodiche che hanno in comune la capacità di attivare cellule del sistema immunitario come i linfociti T (T Cell) contro le cellule tumorali. Pertanto, analizzare l’abilità di indurre morte cellulare (citotossicità) delle T Cell è essenziale per valutare l’efficacia del trattamento. A tal proposito, un esperimento comunemente praticato consiste nel coltivare T Cell insieme a cellule tumorali al fine di osservare le interazioni tra le due popolazioni cellulari e testare la citotossicità delle T Cell. Questi esperimenti, detti co-colture, sono però caratterizzati da numerosi e complessi eventi e scambi tra le due popolazioni, per cui l’utilizzo di tecniche di microscopia time-lapse risulta fondamentale.
Tra le varie tecniche di live-imaging disponibili spicca l’olotomografia di Nanolive, la quale permette di visualizzare cellule in coltura in 3D e in Time-Lapse senza l’utilizzo di marcatori. Tale tecnologia risulta dunque non invasiva (zero danni da fototossicità) e in grado di fornire tutte le informazioni necessarie per valutare la citotossicità delle T Cell. Registrando le due popolazioni nel tempo potremo visualizzare le T Cell trovare (Find) e legare (Bind) le cellule tumorali, per poi causarne lo stress e la morte cellulare (Kill). In figura 1 è possibile osservare un esempio di co-coltura tra T cell e Cancer Cell ottenuto con Nanolive, mentre a questo link potrete trovare ulteriori informazioni riguardo la tecnologia (Leggi Application note: Video killed the imaging star)
Ma una volta ottenuto il video della co-coltura, come facciamo a tradurlo in un risultato? Fortunatamente Nanolive non fornisce solamente video suggestivi, ma ha pure pensato all’analisi evitandoci di dover quantificare manualmente i lunghi e complicati time-lapse di co-colture. Nanolive infatti dispone di un software d’analisi (EVE Analytics) il quale, attraverso l’implementazione dell’Intelligenza Artificiale, permette la quantificazione automatica di svariati parametri e tutte le interazioni e eventi che avvengono in co-colture di T Cell e Cancer Cell.
EVE Analytics quantifica parametri di base come numero di cellule, confluenza, area, ecc, ma anche più complessi come Dry Mass (contenuto cellulare esclusa l’acqua) e Granularity (composizione cellulare interna). Queste misurazioni, combinate al tracking cellulare, saranno in grado di fornirci il profilo fenotipico di entrambe le popolazioni e la quantificazione di ogni evento avvenuto nel corso della co-coltura. L’integrazione di questi parametri avviene grazie al Live T Cell Assay, un modulo di Eve Analytics che permette di ottenere la quantificazione automatica di tutti gli esperimenti di co-coltura registrati con Nanolive.
Nello specifico, Live T Cell Assay effettua una segmentazione automatica delle due popolazioni cellulari, distinguendole dal background e tra loro. Una volta segmentate le cellule appaiono come maschere di differenti colori: le T Cell saranno rosse, le cellule tumorali (Target Cell) blu, mentre in giallo le T Cell in contatto con le Target Cell (Figura 2).
Ottenute le maschere, il software sarà in grado di analizzare e quantificare i 4 differenti step prima menzionati: Find, Bind, Stress e Kill.
Find: Calcolando la motilità delle T Cell, la loro distanza dalle Target Cell e la percentuale di T Cell in contatto con le cellule tumorali Eve Analytics fornisce quantificazione e tempistiche delle T Cell che hanno trovato le Target Cell.
Bind: Utilizzando gli stessi parametri, il software rileva anche il numero di T Cell “legate” alle Target Cell. In questo caso i movimenti delle T Cell saranno ridotti a causa del legame e tale rallentamento permette al software di discriminarle.
Stress: Dopo il Bind, i linfociti T inducono stress nella cellula Target; in questa fase, la quantificazione della Granularity delle Cellule tumorali permette di notare gli effetti di tale stress. Una riduzione della “granularità”, dunque della distribuzione degli organelli e del contenuto cellulare, rappresenta infatti un sintomo di stress.
Kill: Successivamente i linfociti T causano la morte della cellula tumorale. Combinando la semplice quantificazione della Target Cell Area o Confluency e la quantificazione della Dry Mass (la perdita d’acqua è sintomo di morte cellulare) il software rileva immediatamente la morte delle cellule tumorali.
Serial Kill: Infine, per verificare se la T Cell è in grado di uccidere nuovamente, il software continuerà a monitorare la sua attività ripetendo le analisi qui descritte.
In conclusione, i microscopi olotomografici di Nanolive offrono una soluzione completa ed efficace per la visualizzazione e l’analisi di co-colture di linfociti e cellule tumorali, in maniera user-friendly e del tutto automatica, per risultati immediati e stupefacenti.
