Smart Lipid Droplet Assay è tutto grasso che cola

Contaminazioni? Western Blot? Reviewer #3? Qual è il peggior incubo dei ricercatori? Non abbiamo una risposta precisa a questo tragico quesito, ma sappiamo con certezza che la traduzione di termini scientifici in italiano non fa dormire sonni tranquilli ai ricercatori italiani. Un esempio evidente sono le “goccioline di grasso”, dette Lipid Droplet nell’oltremanica. Le Lipid Droplet (LD), oltre ad essere un termine decisamente più elegante, sono strutture subcellulari di forma sferica che si trovano in tutte le cellule eucarioti (Figura 1). Nello specifico sono agglomerati lipidici con un core di lipidi neutri circondati da un monostrato di fosfolipidi e proteine. Considerate semplici inclusioni citoplasmatiche per decenni, le LD stanno emergendo negli ultimi anni come veri e proprio organelli con funzioni chiave nel metabolismo e nell’omeostasi cellulare. I lipidi sono infatti macromolecole essenziali per la vita dell’organismo e della cellula, e la regolazione del metabolismo lipidico da parte delle LD risulta fondamentale in numerosi processi cellulari. Dallo storage di lipidi alla gestione della membrana citoplasmatica, dall’eliminazione di lipidi tossici alla protezione da stress ossidativo, le LD ricoprono un ruolo centrale nel metabolismo cellulare e una loro alterazione risulta in severe patologie. Numerose malattie sono state infatti associate con l’alterazione delle funzionalità delle LD, come obesità, malattie cardiovascolari, lipodistrofia, ecc., attirando di conseguenza l’attenzione di svariati gruppi di ricerca.

Figura 1: Sezione di fegato murino visualizzato con TEM LVEM25 di De Long Instruments. È possibile notare il nucleo (N) dell’epatocita circondato da mitocondri (M) e lipid droplet (LD).

Nonostante il crescente interesse verso le LD, tali organelli e rispettive dinamiche rimangono poco conosciute a causa dell’assenza di tecniche di imaging adeguate. Le LD possono essere visualizzate facilmente con microscopia elettronica (Figura 1) o a fluorescenza, ma l’utilizzo di campioni fissati limita fortemente lo studio delle loro dinamiche. Il live-imaging è dunque la tecnologia più appropriata per l’analisi di questi organelli, ma le LD sono molto sensibili alla marcatura e alla fototossicità complicando ulteriormente la loro visualizzazione. A venire incontro alle esigenze degli studiosi di LD è l’olotomografia, tecnologia che permette la visualizzazione di strutture e dinamiche subcellulari come mitocondri e LD senza l’utilizzo di marcatori fluorescenti. L’assenza di fluorescenza elimina totalmente ogni problema legato alla fototossicità permettendo l’imaging di cellule in vitro per tempi prolungati e alte frequenze. Nanolive risulta dunque un microscopio perfetto per lo studio della struttura e delle dinamiche delle LD (Figura 2).

Figura 2: Singolo frame di un video prodotto con Nanolive. All’interno delle cellule (pre-adipociti murini) è possibile notare numerosi dettagli subcellulari come nucleo, membrana nucleare, mitocondri e lipid droplet (Freccia bianca).

I video prodotti con Nanolive permettono di seguire nel tempo svariati processi cellulari e strutture subcellulari. Tali video vengono definiti multiplexed in quanto caratterizzati da un alto contenuto di informazioni per ogni evento, struttura o popolazione. Estrapolare tutte queste informazioni da questi video complicati non è un’operazione semplice, ma Nanolive ha pensato pure a quello. I microscopi Nanolive sono infatti accompagnati da un software di analisi ottimizzato per i video prodotti con la sua olotomografia. EVE Analytics (nome del software) consente di segmentare le cellule e di ottenere molteplici parametri in maniera veloce e user-friendly. I parametri quantificati dal software sono svariati e forniscono informazioni complete su contenuto, morfologia e popolazione cellulare.

Figura 3: Le maschere generate dall’Intelligenza Artificiale di Eve Analytics. Basandosi esclusivamente sull’indice di rifrazione il software è in grado di discriminare LD e cellule.

Un ulteriore vantaggio di EVE Analytics è la possibilità di integrare moduli d’analisi specifici per esperimenti specifici. Per esempio, è stato rilasciato recentemente lo Smart Lipid Droplet Assay (SLDA), modulo ottimizzato per l’analisi delle LD. Tale upgrade permette la segmentazione label-free delle LD con un’accuratezza maggiore rispetto ai sistemi fluorescence-based [1]. Ottenute le maschere di segmentazione (Figura 3), SLDA calcola 39 parametri garantendo un’analisi completa delle dinamiche delle LD: quantificazione del numero assoluto o per cellula, dei parametri morfologici (forma e dimensione), del contenuto e della distribuzione spaziale all’interno della cellula (Figura 4). Il tutto, con un semplice click.

Figura 4: Lista di tutti i parametri quantificati da SLDA in maniera automatica. I parametri vengono calcolati per LD, per cellula o per entrambi combinati fornendo un’analisi completa su vari livelli.

Lo Smart Lipid Droplet Assay è uno strumento digitale unico che attualmente non trova rivali. L’accuratezza e la precisione delle sue analisi, combinate alla tecnologica label-free di Nanolive, offrono una soluzione unbiased e riproducibile per gli studi sul metabolismo cellulare. La possibilità di visualizzare senza fluorescenza LD nel tempo e ad alta frequenza abbatte i limiti tecnologici attuali e apre nuovi orizzonti in numerosi campi di ricerca.

[1] Puoi scaricare la completa e dettagliata Technical Note a questo link: https://www.nanolive.ch/products/live-cell-analytics/smart-lipid-droplet-assay-live/

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