Il citoscheletro garantisce l’integrità strutturale delle cellule e consiste in un insieme di filamenti e microtubuli proteici presenti nel citoplasma di tutte le cellule. Oltre a conferire la struttura cellulare, permette alle cellule di muoversi e cambiare forma, trasportare vescicole e organelli, contrarre i muscoli e creare il fuso mitotico.
Tra le svariate strutture del citoscheletro troviamo le Stress Fibers, fasci di actina e miosina che assieme formano una struttura regolare nella maggior parte delle cellule non-muscolari. In particolare, questi filamenti sono stati descritti per la loro importanza nella contrazione, adesione e migrazione cellulare, e sono essenziali nella maggior parte dei processi biologici.
La dinamicità di tali strutture rende il loro studio complicato, soprattutto attraverso le tecniche di microscopia convenzionali nelle quali si predilige l’utilizzo di campioni fissati. Strategie di live-imaging diventano dunque essenziali per l’osservazione delle modificazioni delle stress fibers nel tempo e nello spazio. Per marcare i filamenti di actina sono disponibili svariati marcatori fluorescenti, i quali però presentano varie limitazioni sperimentali. I coloranti comunemente utilizzati come la falloidina sono adatti esclusivamente su campioni fissati, limitando enormemente lo studio delle dinamiche delle stress fibers nel tempo, mentre coloranti adatti al live-imaging, possono interferire con la mobilità cellulare oltre che introdurre i classici problemi legati a fototossicità e photobleaching.
Una valida alternativa ai coloranti fluorescenti è l’imaging label-free, ovvero senza alcun marcatore. Questa tipologia di imaging consente la visualizzazione dei processi biologici senza incorrere nelle problematiche sopra elencate. Un esempio di imaging label-free è rappresentato dall’olotomografia di Nanolive, sistema in grado di visualizzare svariati organelli e strutture cellulari senza fluorescenza e senza alterarne la loro struttura. #Nanolive infatti permette di acquisire dati riguardo le stress fibres in maniera unbiased e nel tempo come riportato in figura 1.
Precisamente, in figura 1 è possibile notare cellule mesenchimali staminali in un video olotomografico con una acquisizione ogni minuto per 10 ore totali. Per confermare la visualizzazione delle stress fibers, si è utilizzato SiR-actin, marcatore fluorescente altamente specifico per i filamenti di actina e compatibile con live-imaging. Lo staining è un importante proof-of-concept che dimostra la capacità di Nanolive di visualizzare le stress fibers correttamente, ma impone anche tutte i limiti legati all’utilizzo della fluorescenza. Infatti, sul finire del video (ultimi frame in figura 1) è possibile notare i primi sintomi da stress dovuti alla fototossicità .
Con Nanolive è dunque possibile monitorare colture cellulari per lunghi periodi senza alterazioni, consentendo lo studio del rimodellamento del citoscheletro in condizioni fisiologiche o in risposta a trattamenti.
#Biotecnologia #Imaging #LabelFree
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