Scoprire il contributo di ogni singolo neurone ad ogni singolo comportamento è il sogno di tutti i neuroscienziati. Districare i complessi circuiti neuronali rimane un’impresa titanica, ma l’avanzamento tecnologico ha consentito importanti passi avanti nell’analisi di questi network. Per esempio, la microscopia a 2 fotoni ha permesso la visualizzazione di grandi volumi cerebrali in vivo grazie all’impiego di laser a infrarosso (IR) caratterizzati da un elevato potere penetrante e ridotta fototossicità. Tale tecnologia non solo consente l’osservazione e la localizzazione delle attività neuronali, ma anche la correlazione delle stesse con stimoli esterni e comportamenti dell’organismo. Purtroppo però correlazione non è causalità e dunque la sola informazione correlativa a volte non è sufficiente.
Per valicare questo ostacolo tecnico e concettuale molte strategie sono state adottate ed una soluzione arriva proprio dalla microscopia a 2 fotoni. L’utilizzo degli infrarossi infatti non solo consente l’imaging in vivo, ma anche la stimolazione di specifici neuroni. L’irradiazione mirata di neuroni opportunamente modificati a livello genetico provoca l’innesco di un potenziale d’azione, il quale risulterà nell’attivazione del circuito neuronale e conseguente comportamento. Tale tecnologia, detta foto-stimolazione, permette dunque la localizzazione e osservazione dell’attività neuronale, ma anche il controllo della stessa. La microscopia 2 fotoni è quindi molto utile per correlare attività neuronali all’interno di circuiti, ma anche con comportamenti e stimoli esterni.
Un elegante esempio arriva dal lavoro di Del Maschio et al [1] dove hanno integrato tre metodologie per combinare informazioni strutturali, registrazioni funzionali e registrazioni comportamentali. Lo scopo di questo lavoro era analizzare un circuito di neuroni premotori che controlla un programma motore base come il piegamento della coda in larve di zebrafish (piccolo pesce comunemente utilizzato in ricerca). Nello specifico, hanno combinato foto-stimolazione 3D con 2 fotoni, imaging funzionale 3D con 2 fotoni e tracking del comportamento con LED a infrarossi (Figura 1). L’imaging e la foto-stimolazione sono stati integrati utilizzando il microscopio Femtonics FEMTO SMART.
Grazie a questo sistema e ad una dettagliata analisi computazionale, i ricercatori sono riusciti a correlare e associare specifici circuiti neuronali con il piegamento della coda in zebrafish. Ad esempio, in figura 2A è possibile osservare l’attività di 486 neuroni durante una sessione di foto-stimolazione (4 volte per 2 secondi ciascuna). L’effetto di tali stimolazioni e attività neuronali si traduce nei movimenti della coda della larva, i quali sono descritti in figura 2B.
Nello specifico, in questo esperimento la prima, seconda e quarta stimolazione inducono movimenti della coda nella stessa direzione, mentre la terza risulta in un piegamento repentino della coda in entrambe le direzioni. Tale cinetica è chiaramente riconducibile al movimento natatorio ed è associata ad una maggiore attivazione di neuroni (Figura 2A).
In conclusione, accoppiando il microscopio FEMTO SMART con LED a infrarossi è stato possibile correlare causa e effetto di un circuito di neuroni e un comportamento, direttamente in vivo.
[1] Marco dal Maschio, Joseph C. Donovan, Thomas O. Helmbrecht, Herwig Baier (2017) Linking Neurons to Network Function and Behavior by Two-Photon Holographic Optogenetics and Volumetric Imaging. Neuron, Volume 94, Issue 4, Pages 774-789.e5, ISSN 0896-6273,
