Per Fortuna c’è Nanolive

Nel corso della storia svariate invenzioni sono state ottenute grazie a eventi casuali o, in termini meno formali, colpi di fortuna. Il caso più famoso è senza dubbio la scoperta dell’antibiotico Penicillina, quando Sir Alexander Fleming ritornando da una vacanza ritrovò una piastra Petri di stafilococchi (batteri) contaminata da Penicillium (fungo) e nessun batterio crebbe attorno ad esso. Tali felici scoperte non pianificate prendono il nome di Serenedipità e hanno avuto un ruolo non indifferente nel campo scientifico. Tuttavia, è arduo auspicare che la dea bendata guidi costantemente i nostri avanzamenti scientifici, pertanto, gli scienziati hanno sviluppato procedure e protocolli ben strutturati per ottenere medicinali efficaci senza affidarsi alla sorte. Tali strategie vengono definite Drug Discovery e sono una delle principali attività nel settore farmaceutico.

Nello specifico, il Drug Discovery consiste nell’analisi di numerosi candidati al fine di determinare il miglior composto per un dato scopo terapeutico. Dopo un’attenta selezione delle small molecules, segue la fase di screening in vitro, dove i candidati vengono testati in parallelo utilizzando varie tecnologie, tra cui la microscopia. Esistono numerose tecniche di microscopia che possono favorire la ricerca di potenziali candidati, tuttavia, molte sono caratterizzate da notevoli limiti tecnici (leggi la nostra Application note: Video killed the imaging star). Una valida alternativa alle metodologie di microscopia classica è rappresentata da Nanolive CX-A, microscopio olotomografico in grado di visualizzare colture cellulari in 3D e in Time-Lapse senza l’utilizzo di marcatori fluorescenti. CX-A è una tecnologia label-free, dunque unbiased, che permette di ottenere numerose informazioni a livello cellulare e subcellulare grazie alla sua alta risoluzione spaziale (XY = 200nm) e temporale (1 immagine ogni 7 secondi). Infine, lo stage motorizzato e l’incubatore integrato permettono l’analisi fino a 60 campioni in parallelo garantendo la stabilità delle condizioni vitali del campione. Tutte insieme queste caratteristiche rendono Nanolive CX-A un microscopio perfetto per analisi multiplexed (più informazioni in un unico esperimento) e unbiased (senza pre-selezioni o artefatti) di numerosi campioni in vitro.

Figura 1: Tabella riassuntiva del Drug Screening. 8 inibitori di Kinases sono stati testati a 4 concentrazioni: 0 (Controllo Negativo), 0.1, 1 e 5 volte la concentrazione suggerita da letteratura. Lo screening è stato condotto su 3T3-derived pre-adipocytes, linea cellulare immortalizzata e dunque simile ad una linea tumorale. Per questo esperimento è stato utilizzato Nanolive CX-A con 1 acquisizione ogni 25 minuti per un totale di 40 ore (in figura uno degli ultimi frame). In questo articolo analizzeremo brevemente le condizioni mTOR e JNK inhibitors (in arancione) a confronto con i rispettivi controlli (in verde).

A prova di quanto affermato, riportiamo di seguito un Drug Screening effettuato con Nanolive nel quale sono stati valutati gli effetti di 8 inibitori di chinasi. Le Kinases sono enzimi essenziali coinvolti in numerose funzioni cellulari tra cui metabolismo, proliferazione e apoptosi. La loro sovraespressione o iperattività sono alla base di numerosi tumori umani e dunque la generazione di specifici inibitori ha suscitato grande interesse come trattamento anti-tumorale. In questo screening ne sono stati testati 8, ma per brevità mostreremo 2 esempi significativi nelle seguenti figure. È infatti arduo riassumere in un articolo un così ampio e dettagliato screening in live-imaging, pertanto, consigliamo la visione dell’intero Case Study e il relativo Webinar al link (https://www.nanolive.ch/perturbation-living-cells-kinase-inhibitors/).

Figura 2: Gli effetti dell’inibizione di mTOR su pre-adipocytes. mTOR è una chinasi chiave nella regolazione della crescita cellulare e la sua inibizione comporta un netto aumento dell’area cellulare. Tale trattamento infatti riduce la divisione cellulare, ma aumenta le dimensioni (perimetro e area) delle cellule. Nei riquadri in basso è possibile notare la formazione di vacuoli autofagici (sintomo di stress) e conseguente morte cellulare per apoptosi.
Figura 3: Gli effetti dell’inibizione di JNK su pre-adipocytes. JNK è una chinasi coinvolta nella regolazione della morte cellulare programmata (apoptosi). L’aggiunta di un inibitore di JNK risulta in un evidente stabilizzazione del numero di cellule rispetto al controllo, dove notiamo una classica proliferazione. L’inibizione di JNK induce il blocco del ciclo cellulare, ma anche dell’apoptosi, impedendo sia proliferazione che morte cellulare.
Figura 4: Un ulteriore fenotipo rilevabile dai video con JNK riguarda il metabolismo cellulare. Si può infatti notare come le riserve di Lipid Droplets (LDs) presenti all’inizio del video, vengono esaurite dopo 30 ore nelle cellule controllo, mentre nel campione trattato persistono anche dopo 41 ore. Essendo in serum-free medium, le cellule metabolizzano le LDs per recuperare energie, ma l’inibizione di JNK ne altera il metabolismo.

In conclusione, grazie all’alta risoluzione spaziale di Nanolive è possibile osservare eventi subcellulari, mentre l’alta risoluzione temporale permette di comprendere le tempistiche dei singoli eventi e di avere una visione totale del processo. Nanolive CX-A consente Drug Screening unbiased e multiplexed, rivelando effetti e fenotipi in maniera riproducibile e quantificabile.

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